2024年9月30日，國際學術期刊Nature Biotechnology雜志在線發表了正序生物科學創始人、武漢大學醫學研究院、免疫和代謝前沿科學中心、泰康生命醫學中心、武漢大學中南醫院的殷昊教授科研團隊的研究成果“Rapid generation of long, chemically modified pegRNAs for prime editing”。該研究運用RNA連接技術，成功突破了化學合成RNA的長度壁壘，高效地制備出了高純度的化學修飾pegRNA和epegRNA（分別稱為L-pegRNA和L-epegRNA）。這種方法制備的L-epegRNA在多種細胞系及兩種原代細胞中均展現出了卓越的編輯效率。
▲ Nature Biotechnology發文
核酸藥物，涵蓋了各種形式的DNA或RNA，已成為繼小分子藥物和抗體藥物之后的第三大藥物類別。早期典型的核酸藥物，如小干擾RNA（siRNA）、微小RNA（miRNA）和反義寡核苷酸（ASO），通過與靶RNA配對，實現了對靶基因的抑制。由于這些核酸藥物長度較短，化學合成方法能夠高效且高質量地合成它們，以滿足治療需求。
然而，隨著核酸藥物的不斷發展，CRISPR/Cas系統作為一種新型核酸藥物展示了巨大的潛力。但值得注意的是，該系統所需的sgRNA長度約為100-150核苷酸（nt），遠超早期典型的核酸藥物（<40 nt），且基于CRISPR/Cas系統開發出的招募系統，更是進一步增加了sgRNA的長度需求, 特別是新一代基因編輯技術——先導編輯（Prime Editing, PE）中的核心組件pegRNA，其序列長度較長（至少約125-145 nt），而引入evopreQ1基序的epegRNA，長度更大于170 nt。然而，傳統化學合成RNA的長度通常受限于約100 nt，隨著序列長度的增加，整體合成效率和質量顯著下降，這無疑為這些工具作為核酸藥物的研發帶來了嚴峻挑戰。
正序生物科學創始人殷昊教授長期專注于基因編輯和核酸藥物，開發出高效且經濟的制備高質量化學修飾RNA方法，采用RNA連接技術，通過一系列的優化提升了RNA連接效率，成功制備出長鏈、高質量化學修飾RNA。
首先，科研團隊以sgRNA為模型，采用RNA連接方法，驗證了T4 Rnl2酶在RNA連接中的可行性和高效性。為了進一步提升連接效率，科研團隊開展了一系列優化實驗，從連接溫度、夾板DNA長度、連接比例及酶量等多個維度對RNA連接體系進行了全面的優化，這些優化措施提升了RNA的連接效率。并且通過這種方法連接產生的RNA成功的誘導了基因編輯。
為了更有效地保護pegRNA的3’端，科研團隊設計了三種不同的連接策略，并最終發現當evopreQ1基序與化學修飾聯合使用時，能夠展現出更為出色的性能，實現最高的先導編輯效率。此外，為了去除連接中存在的副產物，科研團隊還引入了高效液相色譜（HPLC）技術，該技術能夠精準且高效地將目標pegRNA從反應混合物中分離純化至較高純度。HPLC純化的L-epegRNA進一步提升了編輯效率。值得注意的是，即便未經HPLC純化的L-epegRNA也展現出了令人滿意的編輯效率。這意味著，不具備HPLC純化實驗條件的情況下也能制備誘導高效先導編輯的L-epegRNA。
科研團隊還對RNP遞送系統進行了系統性優化，并比較優化后的RNP與質粒遞送在多種細胞中的表現。結果顯示，在多數對比實驗中，L-epegRNA介導的RNP遞送均展現出了比質粒遞送更高的編輯效率。
作為另一種廣泛應用于治療與科研領域的策略，RNA遞送也備受關注。科研團隊利用電穿孔轉染技術，成功實現了PEmax mRNA與L-epegRNA的共遞送，并在多種細胞系中實現了高效的編輯。同時，科研團隊還在兩種原代細胞中測試了L-epegRNA，并展現出了出色的編輯能力。相較于體外轉錄的epegRNA, L-epegRNA將先導編輯效率最高提升了數百倍。這預示著其在臨床應用、精準醫療及遺傳病治療等領域具有巨大的應用潛力。
最后，科研團隊還探究了該方法在生成更長RNA方面的能力，通過連接成功制備了210個核苷酸以及234個核苷酸的L-epegRNA，并分別利用RNP和RNA遞送系統實現了高效的長片段插入。
綜上所述，該團隊所開發的方法不僅成功實現了長鏈、高質量化學修飾RNA的高效制備，而且在以pegRNA為模型的測試實驗中得到了充分的驗證。展望未來，這一方法有望被廣泛應用于其他因合成長度受限而難以制備的核酸藥物的研發中。
Nature Biotechnology論文鏈接：
https://www.nature.com/articles/s41587-024-02394-x
