2023年11月20日，國際學術期刊Cell Stem Cell雜志在線發表了正序生物與來自上?？萍即髮W、武漢大學、復旦大學、復旦大學附屬兒科醫院的合作研究團隊共同完成的研究成果“Base editing of the HBG promoter induces potent fetal hemoglobin expression with no detectable off-target mutations in human HSCs”，報道了一種基于變形式堿基編輯器tBE的β-血紅蛋白病基因治療新策略。相比較Cas nuclease和Regular BE的基因編輯療法，該策略可更為精準有效且更加安全地激活γ-珠蛋白表達，為β-血紅蛋白病的臨床基因治療提供了新方案。截至目前，正序生物基于該策略開發的首條針對β-血紅蛋白病的管線已在動物模型中有超過6個月的安全性驗證和有效性觀察，計劃年內進入臨床試驗。
β-血紅蛋白病是一種嚴重的人類常染色體單基因遺傳病，主要包括β-地中海貧血（β-thalassemia）和鐮狀細胞?。╯ickle cell disease）。正常成人血紅蛋白HbA（adult hemoglobin, α2β2）是由兩條α-珠蛋白鏈（α-globin chain）和兩條β-珠蛋白鏈（β-globin chain）組成的四聚體。β-血紅蛋白病因HBB基因的遺傳突變，導致β-珠蛋白生成異常，患者體內缺乏正常的血紅蛋白，需要終身輸血來緩解癥狀。全球有超過3%的人口是β-血紅蛋白病的攜帶者，每年有數十萬新生兒被確診。
人的血紅蛋白四聚體會隨著發育過程發生變化，這個過程被稱為“珠蛋白轉換（globin switching）”。在胚胎時期，主要由α-珠蛋白和γ-珠蛋白所組成的胎兒血紅蛋白HbF四聚體（fetal hemoglobin，α2γ2）進行氧氣的輸送。胎兒出生后，γ-珠蛋白基因（HBG1/2）被沉默，由β-珠蛋白所取代。HBG1/2的表達沉默受到多種轉錄因子的調控作用，其中BCL11A和ZBTB7A是其調控網絡中兩個主要轉錄抑制因子。已有研究表明，重激活胎兒血紅蛋白的表達，可以緩解甚至治愈β-血紅蛋白病，HbF的表達水平越高，則β-血紅蛋白病的臨床緩解程度越好。目前的主要治療策略，是先收集患者的造血干細胞/祖細胞（hematopoietic stem progenitor cells，HSPCs），在體外通過Cas9核酸酶靶向破壞BCL11A的紅系增強子，然后將編輯后的HSPCs重新輸入患者體內，即可在患者體內產生表達HbF的正常紅細胞，從而達到治療目的。但此策略仍存在不足之處，Cas9核酸酶會產生DNA雙鏈斷裂，因此存在造成HSPCs染色體缺失、異位及細胞周期停滯或細胞凋亡等的安全隱患。另一方面，靶向BCL11A紅系增強子是激活HbF表達的間接方式，在某些患者中仍然無法激活高水平的HbF表達。因此，需要進一步探索更安全、更高效重激活γ-珠蛋白的新策略。
在這項最新的研究中，研發團隊構建了完善的實驗體系，開展了一系列基因編輯靶向位點比較和功能驗證的系統研究，證明了一種利用tBE開展β-血紅蛋白病基因治療新方法 （圖1）。首先，研發團隊在細胞系中對γ-珠蛋白調控網絡上下游的六個調控位點進行編輯分析。在所測試的5種胞嘧啶堿基編輯器中， tBE可以在這些調控位點產生高效率的C-to-T突變，且未檢測到gRNA依賴性脫靶突變。然后，研發團隊探索并優化了tBE的RNA表達系統及電轉遞送方法，大幅度提高了tBE在HSPCs中的編輯效率。接下來，研發團隊將tBE的RNA表達系統遞送到HUDEP-2細胞系中，比較編輯不同調控位點所激活產生的γ-珠蛋白表達水平。實驗結果表明，通過破壞BCL11A在HBG1/2啟動子的結合基序，可在這些實驗組中產生最高表達水平的γ-珠蛋白。
圖1. 本研究主要步驟示意圖
為了更好地證明利用tBE 開展β-血紅蛋白病基因治療的潛力，研發團隊在健康人或β0/β0地貧患者來源的HSPCs中將tBE編輯策略與其它臨床或臨床前基因編輯方法進行了比較，在產生了近乎相同水平編輯效率的條件下，tBE靶向編輯位于HBG1/2啟動子的BCL11A結合基序所激活的γ-珠蛋白水平，顯著高于Cas9核酸酶靶向BCL11A紅系增強子策略。另外，研發團隊發現，編輯所產生的突變類型和編輯位點共同決定最終的激活程度。隨后，研發團隊將編輯后的HSPCs移植到免疫缺陷小鼠中，在移植4個月后檢測到tBE編輯的HSPCs可以在小鼠體內重建造血系統，且激活的γ-珠蛋白水平顯著高于靶向破壞BCL11A增強子策略（圖2）。最后，研發團隊對編輯過程中的脫靶事件進行了全面評估。結果證明，經tBE編輯的HSPCs未檢測到高于背景水平的DNA/RNA脫靶突變。
圖2. 編輯效率和激活HbF水平相關性分析。tBE編輯HBG1/2啟動子所激活產生的HbF水平優于現有臨床靶向破壞BCL11A增強子策略
綜上，該研究證明了通過tBE靶向編輯位于HBG1/2啟動子上的BCL11A結合基序，是更為精準有效且更加安全的激活γ-珠蛋白表達的策略，為β-血紅蛋白病的臨床基因治療提供了新方案。
正序生物基于該策略開發了首條針對β-血紅蛋白病的管線，并且正在全力推進該管線進入臨床試驗。除此之外，正序生物利用自主創新的堿基編輯技術融合多治療領域開發了多種創新精準療法，分別針對遺傳疾病、腫瘤、代謝疾病、感染性疾病等布局了近10條管線。正序生物致力于深耕每一條管線并充分了解相關疾病的治療機制，力爭把最高質量、最安全的產品帶給患者。相信在不遠的將來，正序生物基于變形式堿基編輯技術tBE開發的精準療法將幫助罹患嚴重疾病的患者真正實現“一次治療，終身治愈”的效果。
論文鏈接：https://www.cell.com/cell-stem-cell/fulltext/S1934-5909(23)00369-7
